Een spectrofotometer is een van de wetenschappelijke instrumenten die vaak in veel onderzoeks- en industriële laboratoria wordt aangetroffen. Spectrofotometers worden gebruikt voor onderzoek in fysica, moleculaire biologie, chemie en biochemielaboratoria. Typisch verwijst de naam naar ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie.
De energie van licht is afhankelijk van de golflengte, meestal aangeduid als lambda. Hoewel het elektromagnetische spectrum zich over een enorm bereik van golflengten uitstrekt, kunnen de meeste laboratoria slechts een klein deel daarvan meten. UV-Vis-spectroscopie meet tussen 200 en 400 nanometer (nm) voor UV-lichtmetingen en tot ongeveer 750 nm in het zichtbare spectrum.
Voor UV-Vis-spectroscopie worden monsters meestal ingesloten en gemeten in kleine containers die cuvetten worden genoemd. Deze kunnen van plastic zijn als ze in het zichtbare spectrum worden gebruikt, maar moeten kwarts of gesmolten silica zijn als ze worden gebruikt voor UV-metingen. Er zijn enkele machines die glazen reageerbuizen kunnen gebruiken.
Zichtbare spectroscopie wordt vaak industrieel gebruikt voor colorimetrie. Met behulp van deze methode worden monsters gemeten bij meerdere golflengten van 400 - 700 nm en worden hun absorptieprofielen vergeleken met een standaard. Deze techniek wordt vaak gebruikt door textiel- en inktfabrikanten. Andere commerciële gebruikers van UV-Vis-spectroscopie zijn forensische laboratoria en printers.
In biologisch en chemisch onderzoek worden oplossingen vaak gekwantificeerd door hun mate van lichtabsorptie bij een bepaalde golflengte te meten. Een waarde genaamd de extinctiecoëfficiënt wordt gebruikt om de concentratie van de verbinding te berekenen. Laboratoria voor moleculaire biologie gebruiken bijvoorbeeld spectrofotometers om de concentraties van DNA- of RNA-monsters te meten. Ze hebben soms een geavanceerde machine genaamd een NanoDrop ™ spectrofotometer die een fractie van de hoeveelheid monster gebruikt in vergelijking met die gebruikt door traditionele spectrofotometers.
Om kwantificering geldig te laten zijn, moet het monster de Beer-Lambert-wet volgen. Dit vereist dat de absorptie recht evenredig is met de padlengte van de cuvette en de absorptie van de verbinding. Er zijn tabellen met extinctiecoëfficiënten beschikbaar voor veel, maar niet alle, verbindingen.
Veel chemische en enzymatische reacties veranderen in de loop van de tijd en spectrofotometers zijn zeer nuttig voor het meten van deze veranderingen. Bijvoorbeeld, de polyfenoloxidase-enzymen die ervoor zorgen dat fruit bruin wordt, oxideren oplossingen van fenolische verbindingen en veranderen heldere oplossingen in zichtbaar gekleurde. Dergelijke reacties kunnen worden getest door de toename in absorptie te meten naarmate de kleur verandert. In het ideale geval zal de snelheid van verandering lineair zijn, en men kan snelheden berekenen op basis van deze gegevens. Een meer geavanceerde spectrofotometer heeft een temperatuurgestuurde cuvettehouder om de reacties uit te voeren op een precieze temperatuur die ideaal is voor het enzym.
Microbiologische en moleculaire biologielaboratoria gebruiken vaak een spectrofotometer om de groei van bacterieculturen te meten. DNA-kloneringsexperimenten worden vaak in bacteriën gedaan en onderzoekers moeten de groeifase van de cultuur meten om te weten wanneer ze bepaalde procedures moeten uitvoeren. Ze meten de absorptie, die bekend staat als de optische dichtheid (OD), op een spectrofotometer. Je kunt aan de OD zien of de bacteriën zich actief delen of dat ze beginnen te sterven.
Spectrofotometers gebruiken een lichtbron om een reeks golflengten door een monochromator te laten schijnen. Dit apparaat zendt vervolgens een smalle band van licht uit en de spectrofotometer vergelijkt de lichtintensiteit die door het monster gaat met die welke door een referentieverbinding gaat. Als een verbinding bijvoorbeeld wordt opgelost in ethanol, zou de referentie ethanol zijn. Het resultaat wordt weergegeven als de mate van absorptie van het verschil ertussen. Dit geeft de absorptie van de monsterverbinding aan.
De reden voor deze absorptie is dat zowel ultraviolet als zichtbaar licht voldoende energie hebben om de chemicaliën tot grotere energieniveaus te stimuleren. Deze excitatie resulteert in een hogere golflengte, die zichtbaar is wanneer de absorptie wordt uitgezet tegen de golflengte. Verschillende moleculen of anorganische verbindingen absorberen energie op verschillende golflengtes. Degenen met maximale absorptie in het zichtbare bereik worden gezien als gekleurd door het menselijk oog.
Oplossingen van verbindingen kunnen helder zijn, maar absorberen in het UV-bereik. Dergelijke verbindingen hebben gewoonlijk dubbele bindingen of aromatische ringen. Soms zijn er een of meer detecteerbare pieken wanneer de absorptiegraad wordt uitgezet tegen de golflengte. Als dit het geval is, kan dit helpen bij de identificatie van sommige verbindingen door de vorm van de plot te vergelijken met die van bekende referentieplots.
Er zijn twee soorten UV-Vis-spectrofotometermachines, enkele straal en dubbele straal. Deze verschillen in hoe ze de lichtintensiteit meten tussen het referentie- en testmonster. Dubbelstraalmachines meten gelijktijdig de referentie- en testverbinding, terwijl enkelestraalmachines meten voordat en nadat de testverbinding is toegevoegd.